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食品安全國家標準-食品微生物學檢驗-單核細胞增生李斯特氏菌檢驗

GB 4789.30-2010 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗

錄入時間:2010-4-28 9:02:54 來源:國家衛生部

1 范圍
本標準規定了食品中單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的檢驗方法。
本標準適用于食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗。

2 設備和材料
除微生物實驗室常規無菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
2.1 冰箱:2 ℃~5 ℃。
2.2 恒溫培養箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃。
2.3 均質器。
2.4 顯微鏡:10×~100×。
2.5 電子天平:感量 0.1 g 。
2.6 錐形瓶:100 mL、500 mL。
2.7 無菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)。
2.8 無菌平皿:直徑 90 mm。
2.9 無菌試管:16 mm×160 mm.。
2.10 離心管:30 mm×100 mm。
2.11 無菌注射器:1 mL。
2.12 金黃色葡萄球菌(ATCC25923)。
2.13 馬紅球菌(Rhodococcus equi)。
2.14 小白鼠:16 g~18 g。
2.15 全自動微生物生化鑒定系統。

3 培養基和試劑
3.1 含 0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE):見附錄 A 中 A.1。
3.2 含 0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE):見附錄 A 中 A.2。
3.3 李氏增菌肉湯 LB(LB 1,LB 2):見附錄 A 中 A.3。
3.4 1 %鹽酸吖啶黃(acriflavine HCl)溶液:見附錄 A 中 A.3.2.1。
3.5 1 %萘啶酮酸鈉鹽(naladixic acid)溶液:見附錄 A 中 A.3.2.1。
3.6 PALCAM 瓊脂:見附錄 A 中 A.4。
3.7 革蘭氏染液:見附錄 A 中 A.5。
3.8 SIM 動力培養基:見附錄 A 中 A.6。
3.9 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和 V-P 試驗用]:見附錄 A 中 A.7。
3.10 5 %~8 %羊血瓊脂:見附錄 A 中 A.8。
3.11 糖發酵管:見附錄 A 中 A.9。
3.12 過氧化氫酶試驗:見附錄 A 中 A.10。
3.13 李斯特氏菌顯色培養基。
3.14 生化鑒定試劑盒。

4. 檢驗程序
單核細胞增生李斯特氏菌檢驗程序見圖 1。

單核細胞增生李斯特氏菌檢驗

5 操作步驟
5.1 增菌
以無菌操作取樣品 25 g(mL)加入到含有 225 mL LB 1 增菌液的均質袋中,在拍擊式均質器上連續均質 1 min~2 min;或放入盛有 225 mL LB 1 增菌液的均質杯中,8000 r/min~10000 r/min 均質 1 min~2 min。于 30 ℃±1 ℃培養 24 h,移取 0.1 mL,轉種于 10 mL LB 2 增菌液內,于30℃±1 ℃培養 18 h~24 h。
5.2 分離
取 LB 2 二次增菌液劃線接種于 PALCAM 瓊脂平板和李斯特氏菌顯色培養基上,于 36℃±1℃培養 24 h~48 h,觀察各個平板上生長的菌落。典型菌落在 PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落,周圍有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷;典型菌落在李斯特氏菌顯色培養基上的特征按照產品說明進行判定。
5.3 初篩
自選擇性瓊脂平板上分別挑取 5 個以上典型或可疑菌落,分別接種在木糖、鼠李糖發酵管,于 36℃±1℃培養 24 h;同時在 TSA-YE 平板上劃線純化,于 30℃±1 ℃培養 24 h~48 h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養物繼續進行鑒定。
5.4 鑒定
5.4.1 染色鏡檢:李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌,大小為(0.4m~0.5m)×(0.5m~2.0m);
用生理鹽水制成菌懸液,在油鏡或相差顯微鏡下觀察,該菌出現輕微旋轉或翻滾樣的運動。
5.4.2 動力試驗:李斯特氏菌有動力,呈傘狀生長或月牙狀生長。
5.4.3 生化鑒定:挑取純培養的單個可疑菌落,進行過氧化氫酶試驗,過氧化氫酶陽性反應的菌落繼續進行糖發酵試驗和 MR-VP 試驗。單核細胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見表 1。
5.4.4 溶血試驗:將羊血瓊脂平板底面劃分為 20 個~25 個小格,挑取純培養的單個可疑菌落刺種到血平板上,每格刺種一個菌落,并刺種陽性對照菌(單增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌),穿刺時盡量接近底部,但不要觸到底面,同時避免瓊脂破裂,36 ℃±1 ℃培養 24 h~48 h,于明亮處觀察,單增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產生狹小的透明溶血環,英諾克李斯特氏菌無溶血環,伊氏李斯特氏菌產生大的透明溶血環。
5.4.5 協同溶血試驗 (cAMP):在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌, 挑取純培養的單個可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間,垂直線兩端不要觸及平行線,于 30 ℃±1 ℃培養 24 h~48 h。單核細胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌的接種端溶血增強,斯氏李斯特氏菌的溶血也增強,而伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌的接種端溶血增強。

5.5 可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統等對 5.3 中 3個~5個純培養的可疑菌落進行鑒定。

 

食品微生物學檢驗2010標準
食品微生物學檢驗2010標準(GB 4789)已于2010年3月正式頒布并于2010-06-01開始實施.
詳細請看:
GB 4789-2010檢驗標準
GB 4789-2010培養基目錄
食品微生物學檢驗2010標準
GB 4789.1-2010 總則
GB 4789.2-2010 菌落總數測定
GB 4789.3-2010 大腸菌群計數
GB 4789.4-2010 沙門氏菌檢驗
GB 4789.10-2010 金黃色葡萄球菌檢驗
GB 4789.15-2010 霉菌和酵母計數
GB 4789.18-2010 乳與乳制品檢驗
GB 4789.30-2010 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗
GB 4789.35-2010 乳酸菌檢驗
GB 4789.40-2010 阪崎腸桿菌檢驗
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