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食品安全國家標準-食品微生物學檢驗-沙門氏菌檢驗

GB 4789.4-2010 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗

錄入時間:2010-4-28 9:02:54 來源:國家衛生部

前言
本標準代替 GB/T 4789.4-2008《食品衛生微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》。
本標準與 GB/T 4789.4-2008 相比,主要變化如下
——修改了標準的中英文名稱;
——修改了標準的范圍;
——修改了培養基和試劑;
——修改了設備和材料;
——修改了附錄 A。
本標準的附錄 A、附錄 B 為規范性附錄。
本標準所代替的歷次版本發布情況為:
——GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008。

食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗
1 范圍
本標準規定了食品中沙門氏菌(Salmonella)的檢驗方法。
本標準適用于食品中沙門氏菌的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
2.1 冰箱:2 ℃~5 ℃。
2.2 恒溫培養箱:36 ℃±1 ℃,42 ℃±1 ℃。
2.3 均質器。
2.4 振蕩器。
2.5 電子天平:感量 0.1 g。
2.6 無菌錐形瓶:容量 500 mL,250 mL。
2.7 無菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
2.8 無菌培養皿:直徑 90 mm。
2.9 無菌試管:3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。
2.10 無菌毛細管
2.11 pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙。
2.12 全自動微生物生化鑒定系統。
3 培養基和試劑
3.1 緩沖蛋白胨水(BPW): 見附錄 A 中 A.1。
3.2 四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液:見附錄 A 中 A.2。
3.3 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液:見附錄 A 中 A.3。
3.4 亞硫酸鉍(BS)瓊脂:見附錄 A 中 A.4。
3.5 HE 瓊脂:見附錄 A 中 A.5。
3.6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂:見附錄 A 中 A.6
3.7 沙門氏菌屬顯色培養基。
3.8 三糖鐵(TSI)瓊脂:見附錄 A 中 A.7。
3.9 蛋白胨水、靛基質試劑:見附錄 A 中 A.8。
3.10 尿素瓊脂(pH 7.2):見附錄 A 中 A.9。
3.11 氰化鉀 (KCN) 培養基:見附錄 A 中 A.10。
3.12 賴氨酸脫羧酶試驗培養基:見附錄 A 中 A.11。
3.13 糖發酵管:見附錄 A 中 A.12。
3.14 鄰硝基酚-D 半乳糖苷(ONPG)培養基:見附錄 A 中 A.13。
3.15 半固體瓊脂:見附錄 A 中 A.14。
3.16 丙二酸鈉培養基:見附錄 A 中 A.15。
3.17 沙門氏菌 O 和 H 診斷血清。
3.18 生化鑒定試劑盒。

4 檢驗程序
沙門氏菌檢驗程序見圖 1。
沙門氏菌檢驗程序

圖 1 沙門氏菌檢驗程序

5 操作步驟
5.1 前增菌
稱取 25 g(mL)樣品放入盛有 225 mL BPW 的無菌均質杯中,以 8 000 r/min~10 000 r/min 均質 1 min~2 min,或置于盛有 225 mL BPW 的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打 1 min~2 min。若樣 品為液態,不需要均質,振蕩混勻。如需測定 pH 值,用 1 mol/mL 無菌 NaOH 或 HCl 調 pH 至 6.8±0.2。
無菌操作將樣品轉至 500 mL 錐形瓶中,如使用均質袋,可直接進行培養,于 36 ℃±1 ℃培養 8 h~ 18h。
如為冷凍產品,應在 45 ℃以下不超過 15 min,或 2 ℃~5 ℃不超過 18 h 解凍。
5.2 增菌
輕輕搖動培養過的樣品混合物,移取 1 mL,轉種于 10 mL TTB 內,于 42 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。同時,另取 1 mL,轉種于 10 mL SC 內,于 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。
5.3 分離
分別用接種環取增菌液 1 環,劃線接種于一個 BS 瓊脂平板和一個 XLD 瓊脂平板(或 HE 瓊脂 平板或沙門氏菌屬顯色培養基平板)。于 36 ℃±1 ℃分別培養 18 h~24 h (XLD 瓊脂平板、HE 瓊脂 平板、沙門氏菌屬顯色培養基平板) 或 40 h~48 h (BS 瓊脂平板),觀察各個平板上生長的菌落, 各個平板上的菌落特征見表 1。
表1 沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊脂平板

沙門氏菌

BS 瓊脂

菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色,菌落周圍培養基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰綠色的菌落,周圍培養基不變。

HE 瓊脂

藍綠色或藍色,多數菌落中心黑色或幾乎全黑色;有些菌株為黃色,中心黑色或幾乎全黑色。

XLD 瓊脂

菌落呈粉紅色,帶或不帶黑色中心,有些菌株可呈現大的帶光澤的黑色中心,或呈現全部黑色的菌落;有些菌株為黃色菌落,帶或不帶黑色中心。

沙門氏菌屬顯色培養基

按照顯色培養基的說明進行判定。

5.4 生化試驗
5.4.1 自選擇性瓊脂平板上分別挑取 2 個以上典型或可疑菌落,接種三糖鐵瓊脂,先在斜面劃線,再于底層穿刺;接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養基和營養瓊脂平板,于 36 ℃±1 ℃ 培養 18 h~24 h,必要時可延長至 48 h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基內,沙門氏菌屬 的反應結果見表 2。

表 2 沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基內的反應結果

三糖鐵瓊脂

賴氨酸脫羧酶試驗培養基

初步判斷

斜面

底層

產氣

硫化氫

 

K

A

+(-)

+(-)

可疑沙門氏菌屬

K

A

+(-)

+(-)

可疑沙門氏菌屬

A

A

+(-)

+(-)

可疑沙門氏菌屬

A

A

+/-

+/-

非沙門氏菌

K

K

+/-

+/-

+/-

非沙門氏菌

注:K:產堿,A:產酸;+:陽性,-:陰性;+(-):多數陽性,少數陰性;+/-:陽性或陰性。

 

注:K:產堿,A:產酸;+:陽性,-:陰性;+(-):多數陽性,少數陰性;+/-:陽性或陰性。
5.4.2 接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基的同時,可直接接種蛋白胨水 (供做靛基質試 驗)、尿素瓊脂 (pH7.2)、氰化鉀 (KCN) 培養基,也可在初步判斷結果后從營養瓊脂平板上挑 取可疑菌落接種。于 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h,必要時可延長至 48 h,按表 3 判定結果。將已挑菌 落的平板儲存于 2 ℃~5 ℃或室溫至少保留 24 h,以備必要時復查。

表 3 沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表

反應序號

硫化氫
(H2S)

靛基質

pH7.2尿素

氰化鉀
(KCN)

賴氨酸脫羧酶

A1

A2

A3

+/-

注:+陽性;-陰性;+/-陽性或陰性。

注:+陽性;-陰性;+/-陽性或陰性。
5.4.2.1 反應序號 A1:典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN 和賴氨酸脫羧酶 3 項中有 1 項異常,按表 4 可判定為沙門氏菌。 如有 2 項異常為非沙門氏菌。

表 4 沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表

pH 7.2 尿素

氰化鉀(KCN)

賴氨酸
脫羧酶

判 定結果

甲型副傷寒沙門氏菌(要求血清學鑒定結果)

沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)

沙門氏菌個別變體(要求血清學鑒定結果)

注:+表示陽性;+表示陰性。

 

注:+表示陽性;+表示陰性

5.4.2.2 反應序號 A2:補做甘露醇和山梨醇試驗,沙門氏菌靛基質陽性變體兩項試驗結果均為陽性,但需要結合血清學鑒定結果進行判定。
5.4.2.3 反應序號 A3:補做 ONPG。ONPG 陰性為沙門氏菌,同時賴氨酸脫羧酶陽性,甲型副傷寒 沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。
5.4.2.4 必要時按表 5 進行沙門氏菌生化群的鑒別。
表 5 沙門氏菌屬各生化群的鑒別

項目

衛矛醇

山梨醇

水楊苷

ONPG

丙二酸鹽

KCN

注:+表示陽性;-表示陰性。

 

注:+表示陽性; -表示陰性。

5.4.3 如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統,可根據 5.4.1 的初步判斷結果,從營 養瓊脂平板上挑取可疑菌落,用生理鹽水制備成濁度適當的菌懸液,使用生化鑒定試劑盒或全自動 微生物生化鑒定系統進行鑒定。
5.5 血清學鑒定
5.5.1 抗原的準備
一般采用 1.2%~1.5%瓊脂培養物作為玻片凝集試驗用的抗原。
O 血清不凝集時,將菌株接種在瓊脂量較高的 (如 2%~3%) 培養基上再檢查;如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反應時,可挑取菌苔于 1 mL 生理鹽水中做成濃菌液,于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H 抗原發育不良時,將菌株接種在 0.55%~0.65%半固體瓊脂平板的中央,俟菌落 蔓延生長時,在其邊緣部分取菌檢查;或將菌株通過裝有 0.3%~0.4%半固體瓊脂的小玻管 1 次~2次,自遠端取菌培養后再檢查。
5.5.2 多價菌體抗原(O)鑒定
在玻片上劃出 2 個約 1 cm×2 cm 的區域,挑取 1 環待測菌,各放 1/2 環于玻片上的每一區域上 部,在其中一個區域下部加 1 滴多價菌體(O)抗血清,在另一區域下部加入 1 滴生理鹽水,作為對 照。再用無菌的接種環或針分別將兩個區域內的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合 1 min,并對 著黑暗背景進行觀察,任何程度的凝集現象皆為陽性反應。
5.5.3 多價鞭毛抗原(H)鑒定
同 5.5.2。
5.5.4 血清學分型(選做項目)
5.5.4.1 O 抗原的鑒定
用 A~F 多價 O 血清做玻片凝集試驗,同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形 菌株,不能分型。
被 A~F 多價 O 血清凝集者,依次用 O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2 和 O11 因子血清做凝集 試驗。根據試驗結果,判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株,再用 O10、O15、O34、O19 單因 子血清做凝集試驗,判定 E1、E2、E3、E4 各亞群,每一個 O 抗原成分的最后確定均應根據 O 單因 子血清的檢查結果,沒有 O 單因子血清的要用兩個 O 復合因子血清進行核對。
不被 A~F 多價 O 血清凝集者,先用 9 種多價 O 血清檢查,如有其中一種血清凝集,則用這種 血清所包括的 O 群血清逐一檢查,以確定 O 群。每種多價 O 血清所包括的 O 因子如下:
O 多價 1 A,B,C,D,E,F,群 (并包括 6,14 群)
O 多價 2 13,16,17,18,21 群
O 多價 3 28,30,35,38,39 群
O 多價 4 40,41,42,43 群
O 多價 5 44,45,47,48 群
O 多價 6 50,51,52,53 群
O 多價 7 55,56,57,58 群
O 多價 8 59,60,61,62 群
O 多價 9 63,65,66,67 群
5.5.4.2 H 抗原的鑒定
屬于 A~F 各 O 群的常見菌型,依次用表 6 所述 H 因子血清檢查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。
表 6 A~F 群常見菌型 H 抗原表

O 群

第 1 相

第 2 相

A
B
B
C1
C2
D(不產氣的)
D(產氣的)
E1
E4
E4

a
g,f,s
i,b,d
k,v,r,c
b,d,r
d
g,m,p,q
h,v
g,s,t
i



2
5,Z15
2,5


6,w,x

 

不常見的菌型,先用 8 種多價 H 血清檢查,如有其中一種或兩種血清凝集,則再用這一種或兩種 血清所包括的各種 H 因子血清逐一檢查,以第 1 相和第 2 項的 H 抗原。8 種多價 H 血清所包括的 H 因子如下:

H多價1 a,b,c,d,i
H多價2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H多價3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H多價4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H多價5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H多價6 z39,z41,z42,z44
H多價7 z52,z53,z54,z55
H多價8 z56,z57,z60,z61,z62

每一個 H 抗原成分的最后確定均應根據 H 單因子血清的檢查結果,沒有 H 單因子血清的要用兩 個 H 復合因子血清進行核對。
檢出第 1 相 H 抗原而未檢出第 2 相 H 抗原的或檢出第 2 相 H 抗原而未檢出第 1 相 H 抗原的,可 在瓊脂斜面上移種 1~2 代后再檢查。如仍只檢出一個相的 H 抗原,要用位相變異的方法檢查其另一 個相。單相菌不必做位相變異檢查。
位相變異試驗方法如下:
小玻管法: 將半固體管(每管約 1 mL~2 mL) 在酒精燈上溶化并冷至 50 ℃,取已知相的 H 因子血清 0.05 mL~0.1 mL,加入于溶化的半固體內,混勻后,用毛細吸管吸取分裝于供位相變異試 驗的小玻管內,俟凝固后,用接種針挑取待檢菌,接種于一端。將小玻管平放在平皿內,并在其旁 放一團濕棉花,以防瓊脂中水分蒸發而干縮,每天檢查結果,待另一相細菌解離后,可以從另一端 挑取細菌進行檢查。培養基內血清的濃度應有適當的比例,過高時細菌不能生長,過低時同一相細 菌的動力不能抑制。一般按原血清 1:200~1:800 的量加入。
小倒管法:將兩端開口的小玻管 (下端開口要留一個缺口,不要平齊) 放在半固體管內,小玻 管的上端應高出于培養基的表面,滅菌后備用。臨用時在酒精燈上加熱溶化,冷至 50 ℃,挑取因子 血清 1 環,加入小套管中的半固體內,略加攪動,使其混勻,俟凝固后,將待檢菌株接種于小套管 中的半固體表層內,每天檢查結果,待另一相細菌解離后,可從套管外的半固體表面取菌檢查,或 轉種 1%軟瓊脂斜面,于 37 ℃培養后再做凝集試驗。
簡易平板法:將 0.35%~0.4%半固體瓊脂平板烘干表面水分,挑取因子血清 1 環,滴在半固體平板表面,放置片刻,待血清吸收到瓊脂內,在血清部位的中央點種待檢菌株,培養后,在形成蔓 延生長的菌苔邊緣取菌檢查。
5.5.4.3 Vi 抗原的鑒定
用 Vi 因子血清檢查。已知具有 Vi 抗原的菌型有:傷寒沙門氏菌,丙型副傷寒沙門氏菌,都柏林 沙門氏菌。
5.5.4.4 菌型的判定
根據血清學分型鑒定的結果,按照附錄 A 或有關沙門氏菌屬抗原表判定菌型。
6 結果與報告
綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果,報告25 g(mL)樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。

食品微生物學檢驗2010標準
食品微生物學檢驗2010標準(GB 4789)已于2010年3月正式頒布并于2010-06-01開始實施.
詳細請看:
GB 4789-2010檢驗標準
GB 4789-2010培養基目錄
食品微生物學檢驗2010標準
GB 4789.1-2010 總則
GB 4789.2-2010 菌落總數測定
GB 4789.3-2010 大腸菌群計數
GB 4789.4-2010 沙門氏菌檢驗
GB 4789.10-2010 金黃色葡萄球菌檢驗
GB 4789.15-2010 霉菌和酵母計數
GB 4789.18-2010 乳與乳制品檢驗
GB 4789.30-2010 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗
GB 4789.35-2010 乳酸菌檢驗
GB 4789.40-2010 阪崎腸桿菌檢驗
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