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創傷弧菌檢驗標準操作程序



錄入時間:2020-3-25 15:44:24 來源:2020年國家食品污染和有害因素風險監測工作手冊(下卷)-微生物方法SOP

1  方法來源

   FDA/BAM   Chapter 9   Vibrio2004


2  適用范圍

   本程序規定了食品中創傷弧菌(Vibrio vulnificus)的檢驗方法。本程序適用于食品中創傷弧菌的檢驗。

 

3  設備和材料

   除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下。

3.1  恒溫培養箱:36℃±1℃、39.5℃±0.5℃。

3.2  冰箱:2℃~5℃、7℃~10℃。

3.3  恒溫水浴箱:36℃±1℃。

3.4  均質器或無菌乳缽。

3.5  天平:感量0.1 g。

3.6  無菌試管:18 mm×180mm、15mm×100mm。

3.7  無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

3.8  無菌錐形瓶:容量250mL、500 mL、1000mL。

3.9  無菌培養皿:直徑90mm。

3.10  無菌手術剪、鑷子。

3.11  PCR儀。

3.12  電泳裝置。

3.13  凝膠分析成像系統。

3.14  PCR超凈工作臺。

3.15  高速臺式離心機(15000r/min)。

3.16  微量可調移液器(2μL、10μL、100μL、1000μL)和相應吸頭。


4  培養基和試劑

4.1  3%氯化鈉堿性蛋白胨水:見附錄A中A.1。

4.2  改良纖維二糖-多粘菌素B-多粘菌素E(mCPC)瓊脂:見附錄A中A.2。

4.3  纖維二糖-多粘菌素E(CC)瓊脂:見附錄A中A.3。

4.4  3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂:見附錄A中A.4。

4.5  3%氯化鈉三糖鐵瓊脂:見附錄A中A.5。

4.6  嗜鹽性試驗培養基:見附錄A中A.6。

4.7  3%氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗培養基:見附錄A中A.7。

4.8  3%氯化鈉MR-VP培養基:見附錄A中A.8。

4.9  3%氯化鈉溶液:見附錄A中A.9。

4.10 氧化酶試劑:見附錄A中A.10。

4.11 革蘭氏染色液:見附錄A中A.11。

4.12 鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)試劑:見附錄A中A.12。

4.13 Voges-Proskauer(V-P)試劑:見附錄A中A.13。

4.14 生化鑒定試劑盒。

4.15 DNA提取液。

4.16 6×上樣緩沖液。

4.17 0.5×TBE。

4.18 瓊脂糖。

4.19 DNA分子量標記物(100 bp-1000 bp)。

4.20 PCR反應配套試劑。


第一法 定性檢驗

5  檢驗程序

創傷弧菌檢驗程序見圖1。

6  操作步驟  

6.1  樣品制備

6.1.1 非冷凍樣品采集后應立即置7℃~10℃冰箱保存,盡可能及早檢驗;冷凍樣品應在45 ℃以下不超過15min或在2 ℃~5 ℃不超過18 h解凍。

6.1.2 魚類和頭足類動物取表面組織、腸或鰓。貝類取全部內容物,包括貝肉和體液;甲殼類取整個動物,或者動物的中心部分,包括腸和鰓。如為帶殼貝類或甲殼類,則應先在自來水中洗刷外殼并甩干表面水分,然后以無菌操作打開外殼,按上述要求取相應部分。

6.1.3 以無菌操作取樣品25g(mL),加入3%氯化鈉堿性蛋白胨水225mL,用旋轉刀片式均質器以8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或拍擊式均質器拍擊1min~2min,制備成1:10的樣品勻液。如無均質器,則將樣品放入無菌乳缽,自225mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水中取少量稀釋液加入無菌乳缽,樣品磨碎后放入500mL無菌錐形瓶,再用少量稀釋液沖洗乳缽中的殘留樣品1~2次,洗液放入錐形瓶,最后將剩余稀釋液全部放入錐形瓶,充分振蕩,制備1:10的樣品勻液。

6.2  增菌

將上述1:10樣品勻液于36℃±1℃培養18 h~24 h。

6.3  分離

6.3.1 對所有顯示生長的增菌液,用接種環在距離液面以下1cm內沾取一環增菌液,于mCPC或CC平板上劃線分離。于39℃~40 ℃過夜培養(如果達不到39 ℃~40 ℃,則35 ℃~37 ℃)。

6.3.2 典型的創傷弧菌在mCPC和CC平板上呈現為圓的、扁平的、中心不透明邊緣透明的黃色菌落,直徑1 mm~2 mm。

6.4  純培養

挑取3個或以上可疑菌落,劃線接種3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板,36℃±1℃培養18 h~24 h。

6.5  初步鑒定

6.5.1 氧化酶試驗:挑選純培養的單個菌落進行氧化酶試驗,創傷弧菌為氧化酶陽性。

6.5.2 涂片鏡檢:將可疑菌落涂片,進行革蘭氏染色,鏡檢觀察形態。創傷弧菌為革蘭氏陰性,呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態,無芽胞,有鞭毛。

6.5.3 挑取純培養的單個可疑菌落,轉種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層,36℃±1℃培養24 h觀察結果。創傷弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應為底層變黃不變黑,無氣泡,斜面顏色不變或紅色加深,偶爾斜面變黃。

6.5.4 嗜鹽性試驗:挑取純培養的單個可疑菌落,分別接種0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰胨水,36℃±1 ℃培養24 h,觀察液體混濁情況。創傷弧菌在無氯化鈉、8%氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長,在6%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。

6.6  確證鑒定

取純培養物分別接種含3%氯化鈉的賴氨酸脫羧酶試驗培養基、MR-VP培養基,36℃±1℃培養24 h~48 h后觀察結果;3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養物進行ONPG試驗。可選擇生化鑒定試劑盒。創傷弧菌的生化性狀見表1,創傷弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別見表2。

表1   創傷弧菌的生化性狀

試驗項目

結果

革蘭氏染色鏡檢

陰性,棒狀或弧狀

氧化酶

動力

D-纖維二糖

蔗糖

葡萄糖

分解葡萄糖產氣

乳糖

硫化氫

賴氨酸脫羧酶

V-P

ONPG

注:+陽性;-陰性。

 

表2   創傷弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別

名稱

V

P

42

D

D

D

ONPG

嗜鹽性試驗

NaCl含量(%)

0

3

6

8

10

創傷弧菌
V. vulnificus















V







副溶血性弧菌

V. parahaemolyticus



















V













V































溶藻弧菌

V. alginolyticus





















霍亂弧菌

V.cholerae








V














擬態弧菌

V.mimicus





















河弧菌

V. fluvialis









V












V


弗氏弧菌

V.furnissii





















梅氏弧菌

V. metschnikovii









V












V


霍利斯弧菌

V. hollisae









nd













嗜水氣單胞菌

A.hydrophilia



V






V


V



V


V


V









類志賀鄰單胞菌
P. shigelloides

注:nd 表示未試驗;V 表示可變。

6.7   PCR鑒定(選做)

6.7.1  DNA模板的制備

     取可疑的純菌落加入500 μL滅菌dH2O中混勻煮沸10 min,15000×g離心3 min。取上清液儲存在-20℃直至使用。也可以用商業化的DNA提取試劑盒并按其說明提取制備DNA模板。

6.7.2  PCR擴增

6.7.2.1 引物

Vvh-785F

5' ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3'

Vvh-1303R

5' cgc cac cca ctt tcg ggc c 3'

           擴增片段長度:519 bp

6.7.2.2 陰性對照、陽性對照設置

     陰性對照(空白對照)以滅菌水作為PCR反應的模板;

     陽性對照采用含有檢測序列的DNA(或質粒)作為PCR反應的模板。

6.7.2.3 PCR反應體系

試劑

反應體積

dH2O

28.2 μL

10× Buffer. MgCl2

5.0 μL

dNTPs

8.0 μL

引物

7.5 μL

模板

1.0 μL

Taq酶

0.3 μL

總體積

50.0 μL

 

6.7.2.4 PCR反應程序


預變性

94℃

10 min;

變性

94℃

1 min,

退火

62℃

1 min,

延伸

72℃

1 min,25個循環;

終延伸

72℃

10 min;

保存

8℃

——


6.7.2.5 電泳

用0.5×TBE制備1.5%的瓊脂糖凝膠(含EB或Goldview0.5μg /mL,)。各取5 μl PCR產物點樣(可包括適量上樣緩沖液),用DNA分子量標記物做參照,電壓100 V,電泳50 min(根據實驗室儀器情況確定具體電泳條件)。使用凝膠成像系統對電泳結果進行保存和分析。

6.8  結果判定

陰性對照未出現條帶,陽性對照出現預期大小的擴增條帶條件下,如待測樣品未出現519 bp大小的擴增條帶,則可判定該樣品檢驗結果為陰性;如待測樣品出現519 bp大小的擴增條帶,則可判定該樣品檢驗結果為陽性。

如果陰性對照出現條帶和/或陽性對照未出現預期大小的擴增條帶,本次待測樣品的結果無效,應重新進行試驗,并排除污染因素。

6.9 報告

根據生化或PCR結果,報告25 g(mL)樣品中檢出或未檢出創傷弧菌。


第二法 MPN計數法


7  操作步驟

7.1  樣品制備

   同6.1。

7.2  增菌

7.2.1 用滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1 mL,注入含有9 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內,振搖試管混勻,制備1:100的樣品勻液。

7.2.2 另取1 mL滅菌吸管,按6.2.2.1操作程序,依次制備10倍系列稀釋樣品勻液,每遞增稀釋一次,換用一支1 mL無菌吸管。

7.2.3 根據對檢樣污染情況的估計,選擇3個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度接種3支含有9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管,每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內,培養18 h~24 h。

7.3 分離鑒定

   同定性檢測。


結果與報告

  根據證實為創傷弧菌陽性的試管管數,查最可能數(MPN)檢索表,報告每g(mL)創傷弧菌的MPN值。

 

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