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唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢驗標準操作程序



錄入時間:2020-3-27 9:37:20 來源:2020年國家食品污染和有害因素風險監測工作手冊(下卷) - 微生物方法SOP

1   方法來源

    GB 4789.29-xxxx《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢驗》。

 

2   適用范圍

    本程序規定了食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的檢驗方法。


3   設備和材料

3.1   實驗室常規滅菌設備。

3.2   冰箱:2℃~8℃、-20℃~-30℃。

3.3   恒溫培養箱:26℃±1℃、36℃±1℃。

3.4   恒溫水浴鍋:46℃±1℃。

3.5   顯微鏡:10倍~100倍。

3.6   均質器。

3.7   離心機:3000r/min。

3.8   電子天平:感量0.1g。

3.9   比濁計。

3.10  錐形瓶:容量100 mL、500 mL。

3.11  無菌培養皿:直徑90mm、直徑150mm。

3.12  無菌透明玻璃紙、濾紙。

3.13  無菌灌胃器:1mL。

3.14  微生物生化鑒定系統。

3.15  小鼠:18g~20g,每一批次試驗應使用同一品系的KM或ICR小鼠。


4   培養基和試劑

4.1  GVC增菌液:見A.1。

4.2  改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂(mPDA):見A.2。

4.3  PCFA培養基:見A.3。

4.4  馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA):見A.2.1。

4.5  馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂:見A.4。

4.6  卵黃瓊脂:見A.5。

4.7  革蘭氏染色液:見A.6。

4.8  氧化酶試劑:見A.7。

4.9  Hugh-Leifson培養基(O/F試驗用):見A.8。

4.10  蛋白胨水(靛基質試驗用):見A.9。

4.11  緩沖葡萄糖蛋白胨水(MR和VP試驗用):見A.10。

4.12  西蒙氏檸檬酸鹽培養基:見A.13。

4.13  苯丙氨酸培養基:見A.14。

4.14  糖發酵管:見A.15。

4.15  半固體瓊脂:見A.16。

4.16  抗O多價血清、型特異性因子血清(O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ型、O-Ⅷ型)。

4.17  生化鑒定試劑盒。


5   檢驗程序

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌檢驗程序見圖1。

6  操作步驟

6.1  樣品處理

無菌操作稱取25g(mL)樣品,置入盛有225mLGVC增菌液的無菌均質袋中(鮮銀耳樣品取1g,用剪刀剪碎,加入盛有20mLGVC增菌液的無菌均質袋中),用拍擊式均質器拍打1min~2min;或置入盛有225mLGVC增菌液的無菌均質杯中,以8000r/min~10000r/min均質1min~2min;若樣品為液態,振蕩混勻。

6.2  增菌

將上述樣品增菌液置36℃±1℃培養20h~24h。

6.3  分離

用直徑3mm的接種環取增菌液一環,分別劃線接種于mPDA平板和PCFA平板,36℃±1℃培養24 h~48 h。觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上菌落特征見表1。

表1 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌在不同分離平板上的菌落特征

培養基

菌落特征

mPDA 平板

培養24 h后,菌落1 mm~2 mm,紫色,光滑、濕潤、邊緣整齊。培

養48 h后,部分菌落中心可有凸起呈草帽狀。

PCFA 平板

培養24h后,菌落0.5mm~1mm,灰白色,光滑、濕潤、邊緣整齊。

卵黃瓊脂平板

培養24 h后,菌落2 mm~3mm,表面光滑、濕潤,培養48 h后,菌

落周圍形成乳白色混濁環,斜射光下可見菌落及周圍培養基表面呈虹彩現象。

 

6.4  初篩試驗

自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個以上典型或可疑菌落(低于5個全選),分區劃線接種于卵黃瓊脂平板,36℃±1℃培養。挑取培養18~24 h的菌落進行革蘭氏染色及氧化酶試驗。對于革蘭氏染色陰性、氧化酶試驗陰性的菌繼續培養至48 h±2 h,對于卵磷脂酶陽性,帶有虹彩環的單個菌落,接種PDA平板,36℃

±1℃培養24 h±2 h。

6.5  生化試驗

從純培養的PDA平板上挑取菌苔進行生化鑒定。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌生化特征見表2。可選擇生化鑒定試劑盒或微生物生化鑒定系統。

表2 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌生化特征

生化試驗

特 征

O/F 試驗(氧化型)

+

              氧化:

葡萄糖

+

果糖

+

木糖

+

半乳糖

+

蔗糖

-

阿拉伯糖

+

甘露醇

+

側金盞花醇

+

肌醇

+

衛茅醇

+

動力

+

卵磷脂酶

+

氧化酶

-

尿素

+

明膠液化

+

硝酸鹽還原

+

檸檬酸鹽利用

+

精氨酸

+

石蕊牛乳

+

靛基質

-

V-P

-

MR

-

苯丙氨酸脫氨酶

-

H2S 產生

-

注:+表示陽性;-表示陰性。


6.6  血清學分型鑒定(可選擇項)

6.6.1  菌體抗原的制備

將PDA平板36℃±1℃培養24 h±2 h 的培養物用無菌生理鹽水洗下,沸水浴(100 ℃)2h,3000r/min10min離心棄上清液,再用無菌生理鹽水稀釋至5×108~109 CFU/mL菌懸液,作為凝集試驗用抗原。

6.6.2  菌體抗原的鑒定

用多價血清做玻片凝集試驗,同時用生理鹽水做對照。與多價血清凝集者, 依次用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ因子血清做試管凝集試驗。根據試驗結果,判定菌體抗原型。在生理鹽水中自凝者不能分型。生化特征符合,但不能與以上血清凝集者,需保留菌株做進一步鑒定。

6.7  毒性試驗

6.7.1 產毒培養

將初步鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的菌株接種PDA平板,36℃±1℃, 培養24 h±2 h,用滅菌接種環刮取適量菌苔,加到3mL無菌生理鹽水的試管中, 配成1麥氏濃度(McFarland,MCF)的菌懸液(約為108CFU/mL),用無菌吸管吸取0.5mL,滴在鋪好無菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板上,用無菌L棒涂布均勻,26℃±1℃培養5 d。取下帶菌的玻璃紙,將半固體平板置于100℃流動蒸汽滅菌30 min。室溫冷卻后,置-20℃~-30℃冰箱過夜。將冰凍好的半固體平板置室溫融化,用無菌吸管吸出凍融液,經濾紙過濾至無菌試管或錐形瓶中(此為毒素粗提液),4℃避光保存。

同時,將未接種菌苔、鋪好無菌玻璃紙的直徑150 mm馬鈴薯葡萄糖半固體平板作為陰性對照,按照同樣的試驗方法制備陰性對照粗提液,4℃避光保存。

6.7.2 毒力測定

取毒素粗提液或經100℃水浴蒸發后的5~10倍濃縮液,灌胃小鼠3只,每只 0.5 mL,觀察至7 d。若菌株產生米酵菌酸,小鼠在灌胃后20 min~24 h內發病。主要癥狀為豎毛、萎糜不振、躁動,繼而行步蹣跚、肢體麻痹、癱軟、抽搐,呈角弓反張狀,呼吸急促、死亡。

取陰性對照粗提液或經100℃水浴蒸發后的5~10倍濃縮液,灌胃小鼠3只, 每只0.5 mL,觀察至7 d。小鼠應健康存活。

6.7.3 米酵菌酸測定

毒力測定實驗陽性時,分別取毒素粗提液,陰性對照粗提液,按照GB 5009.189執行。

 

7  結果報告

生化試驗符合且毒性試驗陽性,報告檢出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種);生化試驗和毒性試驗有一項不符合,報告未檢出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)。

 

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