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食品中沙門氏菌檢驗解析(1)—沙門氏菌分離

紀旭艷、王娟
錄入時間:2021-1-18 10:17:23 來源:青島海博生物

一、標準


  《GB4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》


二、沙門氏菌簡介


  沙門氏菌為腸桿菌科的無芽孢革蘭氏陰性桿菌,多數有鞭毛,動力強,可引起食物中毒,常存在于蛋類食品或受到糞便污染的食品中。沙門氏菌屬種類繁多,超過了2000個菌型,表面的抗原較為復雜,生化反應特征也存在差異。按照生化反應特征,GB4789.6中將其主要劃分為6個生化群。大多數沙門氏菌不發酵乳糖、賴氨酸脫羧酶陽性、產硫化氫、發酵葡萄糖產酸產氣、尿素酶試驗陰性,也有少數沙門氏菌能發酵或遲緩發酵乳糖(亞利桑那沙門氏菌),不產硫化氫(甲型副傷寒沙門菌、部分豬霍亂沙門氏菌等)。


三、沙門氏菌選擇性分離培養


  1.樣品處理和預增菌


  無菌操作取25g樣品加入至含225mL的BPW均質袋、均質杯或合適的容器中混勻,36±1℃培養8-18h。


  注意事項:若檢驗樣品有尖銳棱角或硬塊時,使用均質袋有破損漏液風險,宜采用均質杯或其他容器進行處理。


  2.選擇性增菌


  分別取1mL的BPW增菌液加入至10mL的SC和TTB培養基中,SC置于36±1℃培養18-24h,TTB置于42±1℃培養18-24h。


  注意事項:(1)標準中選用了兩種培養基進行選擇性增菌培養,目的是為了適應多種沙門氏菌的生長,降低漏檢率,必須兩種培養基同時使用;(2)SC培養溫度是36±1℃,而TTB的培養溫度是42±1℃,必須嚴格按照參考的標準中規定的溫度進行培養。詳情可參考SC培養基原理及現象TTB培養基原理及現象


  3.選擇性分離


  這一步是檢驗過程中至關重要的一步,沙門氏菌種類繁多,生化反應和生長特征也有所不同,即使在同一種選擇性分離平板上也有多種菌落形態。標準中要求使用亞硫酸鉍瓊脂,再從XLD、HE和顯色培養基至少選用一種培養基。同時使用兩種不同的培養基,也是為了提高檢出率。


  (1)亞硫酸鉍瓊脂


  標準中沙門氏菌菌落特征描述:菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色,菌落周圍培養基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰綠色的菌落,周圍培養基不變。


  亞硫酸鉍瓊脂傾向于分離傷寒類沙門氏菌,典型的沙門氏菌可在亞硫酸鉍瓊脂上生長良好,產硫化氫的沙門氏菌菌落通常為黑色,并有金屬光澤,周圍培養基可呈現黑色或棕色;不產硫化氫的沙門氏菌菌落通常為灰綠色,周圍培養基不變色。部分腸桿菌在此培養基上有微弱生長,菌落通常為灰綠色,也有少數產硫化氫的細菌菌落呈黑色有金屬光澤,與典型沙門氏菌特征類似,對可疑菌落的挑選造成干擾。


  傷寒沙門氏菌在BS平板上36±1℃培養40h,菌落呈黑褐色,周圍變棕色,菌落有金屬光澤。


BS平板-傷寒沙門氏菌CMCC50071


  亞利桑那沙門氏菌在BS平板上36±1℃培養40h,菌落呈亮黑色,有金屬光澤,菌落周圍變棕色。



BS平板-亞利桑那沙門氏菌CMCC47001


  甲型副傷寒沙門菌(不產硫化氫)在BS平板上36±1℃培養40h,菌落呈灰綠色,無金屬光澤,菌落周圍不變色。


BS平板-甲型副傷寒沙門菌CMCC50093


  在BS平板上挑取可疑菌落時,優先挑取黑色帶金屬光澤菌落,其次再挑選灰綠色菌落。


  注意事項:BS平板成分較不穩定,應按照標準第一天配制,第二天使用,放置時間不超過48h,存放時間過長會影響培養基使用效果。詳情可參考BS原理及使用方法BS平板配制后不同使用時間目標菌的生長對比


 (2)木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂(XLD)


  培養基簡介:XLD培養基中含有鐵鹽和硫酸鹽,產硫化氫的細菌可還原硫酸鹽生成硫化氫,與鐵鹽反應生成黑色物質,使菌落帶有黑色中心;培養基中含有少量的木糖及較多的蔗糖和乳糖用于細菌糖代謝初步判斷,不能發酵乳糖或蔗糖的細菌通常呈無色或紅色,能發酵乳糖或蔗糖的細菌呈黃色。


  標準中沙門氏菌菌落描述:菌落呈粉紅色,帶或不帶黑色中心,有些菌株可呈現大的帶光澤的黑色中心,或呈現全部黑色的菌落;有些菌株為黃色菌落,帶或不帶黑色中心。


  沙門菌在XLD上大致可分為四種形態:①菌落呈無色或紅色,中心帶黑色或全黑;②菌落呈無色或紅色,不帶黑色中心;③黃色菌落,帶黑色中心;④黃色菌落,不帶黑色中心。


  形態①:菌落呈無色或紅色,中心帶黑色或全黑。




XLD-鼠傷寒沙門氏ATCC14028
XLD-腸炎沙門氏菌CMCC50760

  

  多數沙門氏菌可產硫化氫,不分解乳糖和蔗糖,在XLD平板上菌落呈現無色或紅色,有黑色中心(如圖鼠傷寒沙門氏菌)。部分沙門氏菌可分解XLD培養基中的少量木糖產酸,賴氨酸脫羧反應遲緩,培養早期可觀察到菌落周圍略微偏黃(如圖腸炎沙門氏菌),培養后期分解賴氨酸產堿可使菌落周圍變回紅色。一些產硫化氫的其他菌屬可在此培養基上生長,菌落有黑色中心,為常見干擾菌。


  形態②:菌落呈無色或紅色,不帶黑色中心。


XLD-甲型副傷寒沙門菌CMCC50093


  少數沙門氏菌不產硫化氫,不發酵乳糖,在XLD平板上36℃培養18-24h后菌落呈無色或紅色,無黑色中心。志賀氏菌屬與不產硫化氫、乳糖陰性的沙門氏菌類似,在XLD平板上也呈現為無色或紅色,無黑色中心的菌落。XLD平板也用于志賀氏菌的選擇性分離培養,不產硫化氫的沙門菌與志賀氏菌形態非常相似,互為干擾菌。假單胞菌屬、產堿桿菌屬等在XLD上也為無色或淡紅色透明菌落,一般通過三糖鐵試驗可以排除。

  

  形態③:黃色菌落,有黑色中心;:黃色菌落,無黑色中心。




XLD-奇異變形桿菌CMCC49005
XLD-大腸埃希氏菌ATCC25922 

  

  細菌分解培養基中的乳糖或蔗糖產大量酸,菌落顯黃色。沙門氏菌中,只有部分亞利桑那沙門氏菌可直接分解乳糖產酸。一些細菌可產硫化氫,在菌落中心呈現黑色。但若細菌產酸過多,有時會阻止硫化氫與鐵鹽反應,因此一些產硫化氫的細菌在XLD上部分菌落無黑色中心,需要通過三糖鐵瓊脂進行判斷。


  部分可直接發酵乳糖的亞利桑那沙門氏菌在XLD平板上菌落呈黃色,有或無黑色中心(乳糖遲緩發酵型的亞利桑那沙門氏菌菌落依然顯無色或紅色,有黑色中心)。大腸菌群、普通變形桿菌等發酵乳糖或蔗糖的細菌在XLD平板上菌落也呈黃色,有或無黑色中心,為常見干擾菌。


  在XLD平板上進行可疑菌落選取時,優先級順序為:有黑色中心的紅色或無色菌落>無黑色中心的紅色或無色透明菌落>有黑色中心的黃色菌落>無黑色中心的黃色菌落。詳情參考XLD培養基試驗原理及現象


 (3)HE瓊脂


  HE瓊脂與XLD瓊脂的配方和原理相似,試驗現象也與XLD基本一致,因此在實際檢樣時,HE與XLD選一種即可。






HE-鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028


HE-甲型副傷寒沙門菌CMCC50093








HE-奇異變形桿菌CMCC49005 


HE-福氏志賀氏菌ATCC12022








HE-普通變形桿菌ATCC13315


HE-大腸埃希氏菌ATCC25922


  典型沙門氏菌在HE平板上呈無色或藍綠色透明菌落,有黑色中心;不產硫化氫的沙門氏菌在HE平板上呈無色或藍綠色透明菌落,無黑色中心;少數可發酵乳糖的亞利桑那沙門氏菌在HE平板上顯橙黃色菌落,有或無黑色中心。


  在HE平板上挑取可疑菌落優先順序為:無色或淡綠色透明,黑色中心菌落>無色或淡綠色透明菌落>黃色帶黑色中心菌落。


  詳情參考HE瓊脂原理及現象


 (4)沙門菌顯色培養基


  HE、XLD等傳統培養基主要是依照沙門氏菌的生化反應來進行篩選,部分沙門菌落特征不典型及受多種腸道菌干擾,檢出率較低,易出現漏檢。沙門菌顯色培養基原理與傳統培養基不同,采用的是酶-底物法進行篩選,特異性高,適用范圍廣,抗干擾強。特別是檢驗中遇到不產硫化氫等非典型的沙門氏菌時,顯色培養基比傳統培養基檢出率高很多。 


  有關沙門氏菌詳情參考沙門氏菌顯色培養基介紹


  在沙門菌顯色培養基上,沙門氏菌菌落顯紫色或紫紅色。










鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028





甲型副傷寒沙門菌CMCC50093


  變形桿菌屬、志賀氏菌屬等不發酵乳糖的細菌菌落呈無色、白色或灰色。




奇異變形桿菌CMCC49005
福氏志賀氏菌ATCC12022

  能發酵乳糖的大腸菌群菌落呈藍色或藍綠色。



大腸埃希氏菌ATCC25922

四、總結


  1、樣品處理、增菌、分離培養時,需嚴格進行無菌操作,防止外來污染;


  2、培養基的培養溫度、時間需嚴格按照標準規定執行;


  3、進行可疑菌落挑選時,優先選取典型菌落,其次再選擇非典型菌落,多種培養基結合使用,可提高檢出率。

 

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