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食品中志賀氏菌檢驗簡單介紹(上)

張文慧、紀英姿 
錄入時間:2021-1-25 12:02:05 來源:青島海博生物

一、樣品處理及增菌


  1.樣品的處理


  以無菌操作取樣25g(mL)加入裝有滅菌225mL志賀氏菌增菌肉湯的均質容器中,常用均質容器有均質杯、錐形瓶、均質袋。如圖1-1。


a均質袋;b錐形瓶

圖1-1均質容器


  均質杯多用于不易溶解的固體樣品均質,可將固體樣品切割攪拌均勻;均質袋可置于拍擊式均質器中均質固體,也常用于液體的均質;錐形瓶可置于搖床中,常用于液體的均質。


  2.增菌


  均質后的樣品置于41.5℃±1℃,厭氧培養16h-20h。厭氧培養可使用厭氧培養箱、厭氧培養盒和厭氧培養袋(如圖1-2-1)等。


a均質袋在厭氧袋中培養;b錐形瓶在厭氧袋中培養

圖1-2-1厭氧袋培養


  志賀氏菌在志賀氏增菌肉湯中生長渾濁,如圖1-2-2所示。


a空白管;b福氏志賀氏菌ATCC12022;

c宋內志賀氏菌ATCC25931;d痢疾志賀氏菌CMCC51252

圖1-2-2


二、志賀氏菌的分離


  取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏顯色培養基平板上,于36℃±1℃需氧培養20h-24h。若出現的菌落不典型或菌落較小不易觀察,則繼續培養至48h再進行觀察。


  1.XLD瓊脂平板


  志賀氏菌在XLD瓊脂平板上的菌落特征為粉色至無色,半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊菌落(如圖2-1所示)。志賀氏菌大多不發酵木糖、乳糖和蔗糖,可與發酵此三種糖類的細菌(如大腸黃色菌落)區分;志賀氏菌不還原硫化氫,可與還原硫化氫產黑色硫化鐵的細菌(如大部分沙門等)區分。


a福氏志賀氏菌ATCC12022;b宋內志賀氏菌ATCC25931;c痢疾志賀氏菌CMCC51252

圖2-1志賀氏菌在XLD瓊脂平板上的生長情況

  

  2.MAC或志賀顯色培養基


  志賀氏菌在MAC瓊脂平板上的菌落特征為微黃色菌落,半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊菌落(如圖2-2-1所示)。志賀氏菌大多不發酵乳糖產堿,故菌落顏色為黃色,可與發酵乳糖產酸(菌落顏色為紅色,或有膽鹽沉淀環)的細菌區分。部分宋內志賀氏菌遲緩發酵乳糖,若培養時間過長會產生粉色菌落,混淆結果。


  不產氣(福氏志賀氏菌6型可產生少量氣體),可對比圖3-1-e產氣結果進行判斷。



a福氏志賀氏菌ATCC12022;b宋內志賀氏菌ATCC25931;c痢疾志賀氏菌CMCC51252

圖2-2-1志賀氏菌在MAC瓊脂平板上的生長情況


  志賀氏菌在志賀氏顯色培養基平板上的菌落特征為白色或無色,半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊菌落(如圖2-2-2所示),有些宋內志賀氏菌有藍色中心。



a福氏志賀氏菌ATCC12022;b宋內志賀氏菌ATCC25931;c痢疾志賀氏菌CMCC51252

圖2-2-2志賀氏菌在志賀氏顯色培養基平板上的生長情況


三、初步生化試驗


  自上述選擇性平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落,分別接種三糖鐵瓊脂(TSI)、半固體和營養瓊脂斜面一管,置于36℃±1℃需氧培養20h-24h。


  1.三糖鐵瓊脂


  志賀氏菌在三糖鐵瓊脂TSI中:


  ①斜面產堿呈紅色且底層產酸呈黃色(發酵葡萄糖,不發酵乳糖、蔗糖),如圖3-1-b、c、d;


  ②不產氣(福氏志賀氏菌6型可產生少量氣體),可對比圖3-1-e產氣結果進行判斷;


  ③不產硫化氫,可對比3-1-f產硫化氫(可觀察到黑色)結果進行判斷。


a空白管;b福氏志賀氏菌ATCC12022;b宋內志賀氏菌ATCC25931;

c痢疾志賀氏菌CMCC51252;e大腸埃希氏菌ATCC25922;f沙門氏菌ATCC14028

圖3-1志賀氏菌在TSI瓊脂斜面上的生長情況


  2.半固體培養基


  志賀氏菌在半固體培養基中無動力,如圖3-2-b、c、d所示,3-2-e、f為有動力菌株實驗結果。


a空白管;b福氏志賀氏菌ATCC12022;b宋內志賀氏菌ATCC25931;c痢疾志賀氏菌CMCC51252

e大腸埃希氏菌ATCC25922;f沙門氏菌ATCC14028

圖3-2志賀氏菌在半固體瓊脂上的生長情況


  志賀氏菌在半固體培養基中無動力,只沿穿刺線生長;對比之下,大腸埃希氏菌和沙門氏菌在半固體培養基中有動力,在培養基中擴散生長,觀察培養基會發現穿刺線周圍呈現“混濁”狀態。


四、后續鑒定


  確定符合TSI和半固體培養基中志賀氏菌生化反應結果的可疑菌落,挑取其在已培養的營養瓊脂斜面上生長的菌苔,進行后續生化實驗和血清學鑒定。


五、注意事項


  1、取檢樣時應保證無菌操作,避免引入污染:①取樣工具(藥匙、槍頭等)、均質容器無菌處理;②取樣操作、后續接種操作在無菌環境中進行。


  2、在選擇均質容器時,除了要考慮均質容器的功能性,還要兼顧后續的厭氧培養條件能否實現。如果配備厭氧培養箱,則可自由選擇均質容器;若只能使用厭氧培養盒或厭氧培養袋,則需考慮到均質容器的大小等,以確保厭氧增菌能正常進行。


  3、使用志賀氏增菌肉湯增菌時,需注意培養溫度為41.5℃±1℃且厭氧培養,主要是因為志賀氏菌在此條件下并在含有低濃度碳水化合物的培養基中生長速度超過大腸菌群,以及志賀氏菌在提高溫度時對新生霉素相對耐受。


  3、TSI培養基要制成高層斜面,便于后續試驗觀察,高層斜面是指斜面與底層高度約2:3,即底部高約3cm,斜面長度2cm。


  4、在進行半固體瓊脂穿刺試驗時,接種針不是總能沿穿刺路徑原路返回,導致穿刺路線會側向擴大。進行結果觀察時需注意,半固體培養基的陽性結果是穿刺線周圍的培養基會呈現“混濁”狀態,即有菌的運動和生長,不是單純的側向擴增。


  5、部分不還原硫化氫的沙門氏菌是志賀氏菌分離鑒定過程中的干擾菌,其在XLD、MAC和志賀氏顯色培養基上生長狀態類似,需繼續進行后續實驗才能將其區分。

  注:本文依據《GB 4789.5-2012 食品安全國家標準 食品微生物檢驗 志賀氏菌檢驗》

 

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