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出口畜產品中炭疽桿菌檢驗方法



錄入時間:2006-6-26 9:02:44 來源:其它

   
   中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準 SN 0331—94
            出口畜產品中炭疽桿菌檢驗方法
Methods for the inspection of bacillus anthrax
in animal by-products for export 代替 ZB X09 010—86
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
1 主題內容與適用范圍
本標準規定了出口畜產品中炭疽桿菌的檢驗。
本標準適用于出口鬃、毛、絨、野生動物毛皮、生骨粒及其他畜產品中炭疽桿菌
的檢驗。
2 設備和材料
2.1 離心機:帶容量在 500mL以上的離心管。
2.2 恒溫培養箱:36±1℃。
2.3 恒溫水浴:30~65℃。
2.4 生物學顯微鏡。
2.5 三角燒瓶:容量 250mL、500mL和 1 000mL,帶膠塞。
2.6 平皿:直徑 90mm或 100mm。
2.7 試管:10mm×120mm 和 20mm×140mm 。
2.8 吸管:1 ml和10 ml,帶 0.01 mL 和0.1 mL刻度。
2.9 L形玻璃棒。
2.10 注射器:1 mL 帶 5號針頭。
2.11 棉拭子:長180 mm 的竹簽或鐵絲,一端裹 20~30 mm長的棉球,用水浸濕,另一端
裹在試管的棉塞內,插入試管高壓滅菌。
2.12 棉布袋:70 mm×130 mm,帶縮口繩。
2.13 養鼠罐。 
3 培養基和試劑
3.1 溶菌酶多粘菌素瓊脂:見A1。
3.2 戊烷脒多粘菌素瓊脂:見A2。
3.3 營養肉湯:見A3。
3.4 營養瓊酯:見A4。
3.5 洗樣液:見A5。
3.6 生理鹽水:見A6。
3.7 緩沖生理鹽水:見A7。
3.8 固定液:見A8。
3.9 炭疽桿菌噬菌體:見A9。
3.10 革蘭氏染色液:見A10。
3.11 大豆凝集素稀釋液:見A11。
4 抽樣 
4.1 鬃、毛、絨、生骨粒
4.1.1 抽樣數量
按生產日期或原料來源劃分批次。每批按 30%開包(箱)抽樣或在扎包(裝箱)時由
每包(箱)各取一份樣品。
4.1.2 抽樣方法
用火焰滅菌的鑷子或戴經消毒的乳膠手套從每包(箱)的不同部位共抽樣 3~5g,裝入
滅菌棉布袋內,將袋口扎緊,作上批次標記。
4.1.3 送樣
將樣品裝入塑料袋或鐵桶內,密封后送樣。 
4.2 動物毛皮
4.2.1 抽樣比例
逐張取樣。
4.2.2 抽樣方法
用滅菌棉拭子涂擦樣皮的真皮面。將棉拭子插入試管,塞緊棉塞。
4.2.3 送樣
將試管逐支用紙包裹,裝入鐵桶內,再用棉花或軟紙填充空隙,密封后送樣。
5 樣品處理
5.1 鬃、毛、絨、生骨粒
5.1.1 根據樣品多少將適當數量的同批樣品(最多不超過 10份)合編為一個檢驗樣品單
位,作好記錄。
5.1.2 從合編為一個檢驗樣品單位的每個樣品袋中各取 1~2g樣品,一起放入一個適當
大小的滅菌三角燒瓶中。
5.1.3 加樣品量 30~40倍(W/V)的預冷洗樣液于三角燒瓶,用滅菌膠塞將瓶口塞嚴。
5.1.4 將三角燒瓶放入冰水浴或 0~4℃冰箱內,間或搖動約 1h。
5.1.5 將瓶中洗樣液倒入 500mL滅菌離心管內,蓋住管口,以3000r/min離心20min。
5.1.6 棄去上清液(注意防止污染),加少許滅菌水,使沉淀均勻懸浮。
5.1.7 將離心管靜置 5~10min,待雜質下沉后,將上懸液移入另一支滅菌試管內,于
65℃恒溫水浴加熱 30 min。
5.1.8 加洗樣液后的樣品于熱處理前如不能及時檢驗,應貯于0~4℃冰箱內,以防芽
胞發芽。
5.2 動物毛皮
如不立即檢驗,將棉拭子放于0~4℃冰箱內。
6 檢驗方法
6.1 分離培養
6.1.1 鬃、毛、絨、生骨粒
6.1.1.1 根據每管所包括樣品份數之多少,各接種 1~3個溶菌酶多粘菌素平板或戊烷
脒多粘菌素平板。接種時,用滅菌吸管吸取樣液,滴加于平板表面,各0.1~0.3mL。如有
剩余樣品,可增接數個平板,直至將樣品接種完。
6.1.1.2 用滅菌 L形玻璃棒將滴加的樣液涂布均勻。如樣液較多,可將平板置于36±1℃
溫箱,微開皿蓋,使樣液迅速干燥。
6.1.1.3 翻轉平皿,置于36±1℃恒溫箱,培養 24~48h。
6.1.2 動物毛皮
6.1.2.1 將棉拭子由試管內取出,各涂抹一個溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌平板。
6.1.2.2 翻轉平皿,置于36± 1℃恒溫箱,培養 24~48 h。
6.2 菌落及菌形觀察
6.2.1 將培養的平板取出,用肉眼,必要時借助放大鏡觀察有無典型炭疽桿菌菌落。炭疽
桿菌菌落扁平、暗灰色、不透明、無光澤、表面粗糙、邊緣不整齊。用放大鏡觀察,邊緣
呈卷發狀,用接種針探觸,有粘滯感,挑之,可拉起絲。
6.2.2 從典型或可疑菌落取培養物制備涂膜,經革蘭氏染色,鏡檢。炭疽桿菌被染成藍
紫色,由多個菌縱連成長鏈。少數單個菌呈大桿狀,兩端平齊。有的菌體中央可見卵圓形
不著色的芽胞。芽胞不使菌體膨大。
6.3 肉湯培養特性觀察
取菌落和菌形均似炭疽桿菌的培養物,接種肉湯管,于 36±1℃恒溫箱培養 5~12h,
觀察細菌生長情況。炭疽桿菌在肉湯中生長初期的特征是:肉湯上部澄清,無菌膜,下部
有絮狀沉淀,沉淀不易搖散。
6.4 確定試驗
6.4.1 大豆凝集素吸收試驗
6.4.1.1 方法
a. 加大豆凝集素稀釋液(A11)一滴于比色板或載玻片上。
b. 用接種環取一滿環可疑菌落,研混于大豆凝集素稀釋液內成濃厚菌液,持續攪拌
2~3min。
c. 加一滴 5%兔血球懸液,攪勻,前后傾動玻片 3~5min,觀察血球是否凝集。
6.4.1.2 判定
++++:血球凝集成塊狀,均勻散布,液體無色。
+++:血球凝集成大顆粒,均勻散布,液體無色。
++:血球凝集成顆粒,均勻散布,液體無色。
+:血球凝集成細小顆粒,均勻散布,液體無色。
±:血球凝集成細微顆粒,均勻散布,液體呈不顯著黃紅色。
-:血球不凝集,搖動后匯集于中央,呈淡黃紅色,液體呈不顯著黃紅色。
注:“+++”~“+”為陽性。“±”為可疑。“-”為陰性。
6.4.2 噬菌體裂解試驗
6.4.2.1 方法
a. 用營養瓊脂平板的皿底外面畫三個直徑約 30mm ,相隔約 20mm為圓圈。
b. 用接種環取可疑炭疽桿菌的新鮮肉湯培養物涂滿與兩個圓圈相對應的瓊脂表面。
另取已知炭疽桿菌的新鮮肉湯培養物,涂滿與第三個圓圈相對應的瓊脂表面,作上區分的
標記。
c. 待菌液被吸干后,在接種被檢菌的圓圈內,一個加一滴無菌肉湯,另一個加一
滴炭疽桿菌噬菌體。在接種已知炭疽桿菌的圓圈內,加一滴炭疽桿菌噬菌體。
d. 將平皿放入36±1℃ 恒溫箱(隔架面要平,以防噬菌體液流散),微開皿蓋,使
液體迅速干燥。然后翻轉平皿,培養12~18h。
6.4.2.2 判定
a. 加噬菌體的兩個圓圈內都出現蝕斑,加肉湯的圓圈內無蝕斑,為陽性反應。
b. 加已知炭疽桿菌的圓圈內出現蝕斑,加被檢菌的兩個圓圈內無蝕斑,為陰性反應。
c. 三個圓圈內都無蝕斑,表明噬菌體已失效,應另換有效噬菌體進行試驗。
6.4.3 串珠試驗
6.4.3.1 方法
a. 取適量 4~12h可疑炭疽桿菌肉湯培養物,接種于 1.8mL肉湯管內(制備濕片在低
倍顯微鏡下檢查,每個視野應含菌鏈 5~10條)。
b. 加 5IU/mL青霉素 0.2mL,使青霉素最終濃度為 0.5IU/mL 。
C. 于 37℃水浴培養 1~2h ,取出,加入 20% 福爾馬林 0.25 mL,固定 10 min。
d. 制備濕片,在顯微鏡下檢查。
6.4.3. 判定
++++:菌體大而圓,均勻,排列整齊;
+++:菌體圓,均勻,排列整齊;
++:菌體橢圓,排列整齊;
+:菌體均勻腫大,變粗;
±:菌體大小不一,不圓,排列不整齊;
-:菌體形態無變化。
注:“++++”~“+”為陽性。“±”為可疑。“-”為陰性。
6.4.4 動物試驗
6.4.4.1 取可疑炭疽桿菌的肉湯培養物,用生理鹽水稀釋為 10 000個菌/mL(微混濁),
接種 2~3只小白鼠。一只于皮下注射 0.1mL;其余每只于腹腔注射 0.2mL。
6.4.4.2 如小白鼠死亡(通常于1~3d內),立即進行剖檢,觀察有無炭疽病理變化(如皮
下膠樣水腫,脾臟腫大,血凝不良),制備數張血液和腹水涂片,供做菌形檢查,同時取
病變材料或體液接種數管肉湯,以備核查。
6.4.5 染色鏡檢
6.4.5.1 染色液的配制
A液:
美藍 0.3g
乙醇(95%) 30.0mL
B液:
0.01%氫氧化鉀溶液 100mL
將 A、B兩液混合而成。
6.4.5.2 染色方法
a. 將被檢材料的涂片浸入固定液內 15~20 min;
b. 滴加染色液浸沒涂膜,染色 1~2 min;
c. 用水沖去染色液,自然干燥或用吸墨紙吸干水分;
d. 鏡檢。
6.4.5.3 判定
炭疽菌菌體呈藍色,粗大桿狀,兩端平齊,相連成短鏈或成對,菌體周圍以淡藍紫色
莢膜。
7 結果的判定和報告
7.1 結果的判定
在菌落形態、細菌形態和肉湯生長特性三項中有一項不符合炭疽桿菌特征時,判為
非炭疽桿菌。在其余五項試驗(確定試驗)中有兩項或更多項不符合炭疽桿菌特征時,判
為非炭疽桿菌;全部符合或僅有一項不符合炭疽桿菌特征時,判為有炭疽桿菌。
7.2 結果的報告
7.2.1 凡結果判為非炭疽桿菌的檢驗樣品,報告該樣品所代表的同批產品“經檢驗未發
現炭疽桿菌”。
7.2.2 凡結果判為有炭疽桿菌的檢驗樣品,報告該樣品所代表的同批產品“經檢驗發現
炭疽桿菌”。
附 錄 A
培養基和試劑
(補充件)
A1 溶菌酶多粘菌素瓊脂(Knisely)
營養瓊脂(見A4) 1 000mL
多粘菌素 3 000IU
溶菌酶 4 mg/mL 溶液 10 mL
乙酸亞鉈 4 mg/mL 溶液 10 mL
EDTA 20 mg/mL 溶液 10 mL
除營養瓊脂外,將其他成分用滅菌蒸餾水配成適當貯備液,按以上量加于冷至 50~
55℃ 的滅菌營養瓊脂內,充分搖勻,傾注平板。
A2 戊烷脒多粘菌素瓊脂
A2.1 基礎培養基
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 20.0g 
氯化鈉 5.0g
瓊脂 20.0g
蒸餾水 1 000.0mL
將各成分加于蒸餾水中,煮沸至完全溶解,調整pH至7.4,過濾,分裝于三角燒
瓶中,每瓶 400mL,121℃高壓滅菌 20min。臨時用加熱融化,放于 45~50℃恒溫水
浴內保溫。
A2.2 戊烷脒稀釋液
稱取戊烷脒 0.1g,溶于 4mL滅菌蒸餾水內。貯存在 0~4℃ 冰箱,備用。
A2.3 多粘菌素稀釋液
取多粘菌素 B一瓶,加滅菌蒸餾水使其溶解,再用滅菌蒸餾水將其稀釋為3000IU/mL。
貯存于0~4℃冰箱,備用。
A2.4 脫纖維羊血
以無菌操作采羊血 50~10 mL ,注入含玻璃小珠的滅菌三角燒瓶中,立即轉搖數分
鐘。貯存于 0~4℃冰箱,備用。
A2.5 完全培養基
基礎培養基(45~50℃) 400.0 mL
戊烷脒稀釋液 0.4 mL
多粘菌素稀釋液 0.4 mL
脫纖維羊血 8.0 mL
以無菌操作將后三種成分加入基礎培養基內,充分搖勻,傾注于滅菌皿內,每皿15mL
左右。
A3 營養肉湯.
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 20.0g
氯化鈉 5.0g
蒸餾水 1000.0mL
將各成分溶于蒸溜水中,調整pH至7.4,分裝于試管內,每管1.0mL,121℃高壓滅菌15min。 
A4 營養瓊脂
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 20.0g
氯化鈉 5.0g
瓊脂 20.0g
蒸餾水 1 000.0mL
將各成分加于蒸餾水中,煮沸至完全溶解,補足失去的水分,調整pH至7.2,過濾,
121℃ 高壓滅菌 20 min 。待冷至 50℃左右時,傾注于平皿,制成平板。
A5 洗樣液
吐溫-20 2.5mL
蒸餾水 1 000mL
將吐溫-20加于蒸餾水中,充分攪勻,分裝于三角燒瓶或試劑瓶內,121℃高壓滅菌。
貯存于 0~4℃冰箱,備用。
A6 生理鹽水
氯化鈉 8.5g
蒸餾水 1000.00mL
待氯化鈉完全溶解后,分裝于三角燒瓶或試劑瓶內,121℃高壓滅菌 20min。
A7 緩沖生理鹽水
無水磷酸氫二鈉 1.42 g
氯化鈉 8.50 g
蒸餾水 1 000.00 mL
將各成分加于蒸餾水中,加熱攪拌使完全溶解。如欲長期保存,可加 0.1g硫柳汞(最
終濃度為 0.01%)。
A8 固定液
無水乙醇 600 mL
三氯甲烷 300 mL
甲醛溶液(36%~38%) 100 mL
將三種成分混勻,貯存于磨砂口帶蓋試劑瓶內。
A9 炭疽桿菌噬菌體
γ或 ω型的均可使用。
A10 革蘭氏染色液及染色方法
A10.1 Hucker 氏結晶紫液
A液:
結晶紫(或龍膽紫) 2.0g
⿳ 乙醇(95%) 20.0mL
B液:
草酸銨 0.8g
蒸餾水 80.0 mL
將 A、B兩液混勻,放置 24 h后,用粗濾紙過濾。貯于磨砂口滴瓶內。 
A10.2 革蘭氏碘液
碘 1.0 g
碘化鉀 2.0 g
蒸餾水 300.0 mL 
將碘和碘化鉀放于乳缽內,研成細粉。先后分三次分別加蒸餾水1mL 、5mL和10 mL,
繼續研磨至完全溶解,倒入褐色瓶中。再加水將殘留于乳缽的碘液洗入瓶中,補加蒸餾水
至300mL。
A10.3 脫色劑
95%乙醇 適量
貯于磨砂口滴瓶中。
A10.4 Hucker氏復染液(貯備液)
沙黃 O 2.5 g
乙醇(95%) 100mL
臨用時,取適量貯備液,加蒸餾水稀釋成 1:10稀釋液。
A10.5 染色方法
a. 于載玻片上制備涂膜,自然干燥;
b. 將玻片浸入固定液內,固定 1 min;
c. 加結晶紫于涂膜上,染色 1 min;
d. 用水沖去染色液,淋去多余的水; 
e. 加革蘭氏碘液于涂膜上,媒染 1 min;
f. 用水沖去碘液;
g. 連續加 95%乙醇流過涂膜,至無紫色脫掉;
h. 用水沖洗玻片,淋去多余的水;
i. 加復染液于涂膜上,染色 10~30 s;
j. 用水沖去染色液;
k. 用吸墨紙吸干水分或自然干燥;
l. 鏡檢。
A11 大豆凝集素稀釋液
按試劑使用說明制備工作稀釋液,貯于 4℃冰箱備用。
━━━━━━━━━
附加說明:
本標準由中華人民共和國進出口商品檢驗局提出。
本標準由中華人民共和國內蒙古進出口商品檢驗局負責起草。
本標準主要起草人甄宏太、周云霞。
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
中華人民共和國國家進出口商品檢驗局 1994-12-26批準 1995-05-01實施

 

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